Определение зараженность болезнями

92.3 

Категория:

Описание

Зараженность семян болезнями — наличие на поверхности или внутри или в мижнасинневому пространстве жизнеспособных патогенов, повлекших или способны при благоприятных условиях вызвать поражение «семена, проростков и растений, вегетируют, болезнями с характерными симптомами.

Определяя зараженность семян болезнями, устанавливают наличие или отсутствие грибных и бактериальных болезней, их возбудителей, видовой состав и степень зараженности.
Основной показатель зараженности семян болезнями — отношение количества зараженного семена к учетной, выраженное в процентах. В отдельных видов болезней он выражается количеством патогена (его преобразований) в граммах или штуках на единицу массы или площади поверхности семена или одну семечко.
Стандарт устанавливает следующие методы определения зараженности семян возбудителями болезней:
— макроскопический;
— омовение семян и центрифугирования суспензии спор;
— отпечатков;
— анализ зародышей;
— биологический;
— люминесцентный.
Выбор методов определяет аналитик в зависимости от культуры, наличия и характера симптомов болезней семян и биологических особенностей их возбудителей.
Макроскопический метод
Метод применяют для визуально обнаружить в семенах головневые образования, рожки злаков и другие грибы, а также галлы пшеничной нематоды (приложения Ш, Ю).
Анализ проводят одновременно с определения чистоты семян (раздел 5).
Зараженность семян головневыми творениями и рожками злаков выражают в процентах зид массы пробы, а Галама пшеничной нематоды — в штуках на 1 кг семян.
Метод омовения семян и центрифугирования суспензии спор
Применяют для определения зараженности семян болезнями, возбудители которых в виде спор или мицелия находятся на его поверхности:
— твердая и стеблевой головни пшеницы и ржи;
— твердая (каменная) и черная головни ячменя;
— летучая головня кукурузы;
— обычная головня проса;
— гельминтоспориоз, фузариоз и головня риса.
Для анализа со средней пробы выделяют четыре рабочие пробы по 100 семян в каждой.
Каждую пробу помещают в пробирку, заливают 10 см3 воды и взбалтывают. Семена с гладенькою поверхностью (пшеница, рожь) взбалтывают в течение 5 мин, семена с шероховатой поверхностью (свеклу

Метод отпечатков поверхности зародышей семян
Предназначен для определения зараженности семян пшеницы твердой головней в зоне за¬родка. Он дополняет предыдущий метод и его целесообразность обусловлена ​​определяющим значением тех спор возбудителя болезни, которые содержатся на поверхности зародышей семян пшеницы.
С средней пробы культуры выделяют 100 семян. От каждой из них на клейкой прозрачной ленте, которую закрепляют на предметном стекле (вверх клейкой поверхностью), получают отпечатки поверхности зародышей. Для этого один конец ленты приклеивают к краю стекла отдельным кусочком такой же ленты длиной около 1 см (одна его половина сверху на ленте, вторая — на стекле с нижней стороны). В ленту кладут полоску резины (лучше светлого цвета) толщиной 2-3 мм; легко натягивая ленту, накрывают ней полоску резины и аналогичным способом приклеивают ее к другому концу предметного стекла.
Отпечаток зародыша одержують легким нажатием до клейкой поверхности ленты, удерживая семя цанговым зажимом. В зажим семя подают пинцетом челкой вперед.
Отпечатки располагают 2-3-мя строками по 10 шт. в каждом. Общее количество отпечатков на одном предметном стекле — 20-ЗО шт. Для удобства просмотра под микроскопом рекомендуется каждый отпечаток очертить пастовых карандашом.
Чтобы удалить резиновую полоску, на одном конце предметного стекла приклеивают клейкими сторонами основну ленту с концом такой же ленты, затем скальпелем разрезают первую на конце предметного стекла, освобождают от резиновой полоски и снова приклеивают ленту к стеклу ранее приведенным способом.
Просматривают отпечатки поверхности зародыша под микроскопом с 150-600-кратного увеличения с целью выявить, распознать и подсчитать количество спор на единице площади. Споры подсчитывают в тех местах зародка, где его отпечатки на ленте оказались полными. Подсчитывают количество спор в каждом из двух полей зрения микроскопа за каждым отпечатком; используя для удобства окулярную сетку, особенно в случае большой заспорености семян.
Среднее количество спор на единицу площади поверхности зародышей семян пшеницы, шт. / Мм2,

Метод анализа зародышей
Применяют, чтобы выявить мицелий возбудителя пыльной головни (иэШадо эр.) В зародышах семян пшеницы и ячменя, отделенных от эндосперма.
Для анализа со средней пробы выделяют навески массой 100 г для пшеницы и 120 г для ячменя.
Чтобы отделить пленки перед анализом зародышей семян ячменя кладут на 40 мин в 50% -ный раствор серной кислоты (концентрированную химически чистую серную кислоту разбавляют наполовину, доливаючы кислоту в воду). Затем семена тщательно перемешивают, промывают проточной водой, а остатки пленок оттирают на сите капроновой щеткой.

Зародыши семян пшеницы и ячменя отделяют от эндосперма двумя способами.
Первый способ. Семена замачивают в стеклянной или эмалированной посуде в 1 дм3 горячего свижопри-
изготовленных раствора щелочи (КОН или №ОН — 100 г на 1 дм3 воды), в котором растворен анилиновый синий краситель для хлопчатобумажных тканей или трипановый синий «для Михр» в количестве 1 г на 1 дм3 раствора щелочи, и оставляют в термостате при температуре 24 ° С в течение 12-24 ч. Содержание периодически перемешивают стеклянной палочкой, зародыши отделяются в 80-90% семян. Затем содержимое сосуда пропускают через набор лабораторных решет с диаметрами отверстий 5, 3 и 1 мм и промывают проточной водой. За¬родкы оседают на нижнем решете с диаметром отверстий 1 мм. Окрашенные зародыши переносят в колбу вместимостью 250 см3 с 20% -м раствором щелочи (200 г на 1 дм3 воды), взятого в количестве 200 см3, и кипятят в течение 10-15 мин. Затем зародыши помещают в чайное цидильце, тщательно промывают проточной во¬дою, переносят в колбу с 50% -ной молочной кислотой и снова кипятят в течение 1 мин.
Второй способ. Семена кладут в эмалированную или стеклянную посуду, заливают 3% -м раствором щелочи и кипятят около 1 ч до полного отделения зародышей от эндосперма.
Затем содержимое из сосуда пропускают через набор лабораторных решет с диаметрами отверстий 5, С и 1 м
с последующим промыванием их проточной водой. Зародыши, которые остались на нижнем решете, переносять в колбу вместимостью 250 см3 и кипятят в течение 40 мин в 15- 20% -ном растворе щелочи, взятом 8 количе «200 см3; после этого их тщательно отмывают от щелочи. Отмытые зародыши помещают в стеклянную бюкс абс колбу, куда предварительно налито небольшое количество раствора анилинового синего или трипанового синьогс красителя концентрацией 0,1% и кипятят в течение 10-20 с. Работая с химикатами надо строго где тримуватись мер безопасности. Потери зародышей после всех операций не должны превышать 20%. Зародыша можно хранить в 50% -ном водном растворе глицерина. После кипячения каждый зародыш просматривают пи … микроскопом или бинокулярной лупой за 12-15-кратного увеличении. В поле зрения должно быть вида: один зародыш. Использовать покровное стекло во время просмотра зародышей не требуется.
Для анализа отбирают четыре пробы по 500 зародышей. Препаровальной иглой абс скальпелем их раскладывают на предметных стеклах или в чашках Петри ровными рядами, очерченным • восковым карандашом, и рассматривают под микроскопом, со стороны зародышевой почки, корешков и колеоптиля (где ение Ю), где может содержаться мицелий, и со стороны щитка. В случае малого увеличения микроскопа грибница збуд¬ника головни имеет вид клубочков спутанных гиф мицелия. Гифы окрашиваются в сине-голубой колес имеют толщину около 3 мкм. Кроме головневых, в ткани щитка изредка случаются другие грибы, но 5 пова их мицелия отличная и их можно четко распознать.
Подсчитывают все зараженные зародыши независимо от места сосредоточения мицелия и определяю: зараженность семян головней в процентах в каждой пробе и в среднем в анализируемой партии семян
Биологический метод
Применяют, чтобы выявлять внешнюю и внутреннюю зараженность семян болезнями. Он ЗЭСНОЕ? с- н / и на стимулировании роста и развития патогенных микроорганизмов в зараженном семенах.
Зараженность семян определяют при проращивания во влажной камере в рулонах фильтровальная: бумаги, на песке или на питательных средах.
Во время проращивания семян во влажной камере бактериальные болезни определяют по г. г. якшенистю и ослизненистю тканей семян. Грибные болезни проявляются на проросшем и непроросшими, семенах как пятна различной формы и окраски, налет грибницы, пикниды, уродство, деформация вилмирання частей проростков.
Чтобы контролировать правильность распознавания патогенов применяют микроскопирования.
С средней пробы выделяют четыре повторы по 50 или 100 семян в зависимости от с …. культур.
Для проращивания семян во влажной камере используют стерильные сухие чашки пь .. Коха или стакана, накрытые стеклом. На их дно кладут три слоя марли или два слоя фильтровальной папе • :.
Марлю или фильтровальную бумагу в чашках Петри или Коха увлажняют водой из пипетки, трсч.и открывая при этом с одной стороны крышку чашки. Увлажнения становится нормальное, когда наклон • и -иашку с марлевых или бумажных кружков стекает несколько капель воды.
Семена пинцетом раскладывают на расстоянии 1-2 см друг от друга в зависимости от его крупност1
Закрытые чашки Петри, Коха или стакана с заложенным в них семенами ставят в термостаты для г 5Сщування.
Термостаты перед анализом тщательно моют горячей водой с моющими ззсс .. ■■ = дезинфицируют 1% раствором марганцовокислого калия через каждые 10 дней. Перед каждым фг: алогичным анализом их дезинфицируют 96% -ным этиловым спиртом или бактерицидной лампой лссч- ИВС ЗО мин-Ежемесячно термостаты дезинфицируют бактерицидными лампами в течение 8 часов.

Чашки Петри, марля, фильтровальная бумага, пипетки, которые предназначены для анализа, должны быть стерильны. Руки, стекло, на котором выделяют навески и отчисляют семян, совки, чашки весов, ростильни и другие предметы дезинфицируют спиртом. Чашки Петри и Коха с марлевыми кружками или фильтровальной бумагой, а также пипетки обертывают бумагой и стерилизуют в сушильном шкафу при температуре (13О ± 2) ° С в течение 1 ч (в случае срочного использования их стерилизуют НЕ заворачивая в бумагу) или в автоклаве под давлением 0,09807 МПа (1 атм) в течение 40-50 мин. Металлические предметы (пинцеты, препару¬вальни иглы и т.д.) стерилизуют над пламенем спиртовой или газовой горелки в процессе работы. Воду стерилизуют в автоклаве в течение ЗО мин под давлением 0,09807 МПа (1 атм). Можно использовать свижокипьячену воду. Ее кипятят в химических колбах, закрытых ватными пробками, в течение 30 мин, почи¬наючы с момента закипания. Для анализа воду охлаждают до комнатной температуры.
фитопатологического оценки семян пшеницы, ржи, ячменя, овса, кукурузы, льна, сои, подсолнечника и гороха проводят в сроки, установленные 11.6 этого стандарта, а семена других культур — в сроки, установленные для определения его сходства согласно приложением П. Виды болезней семян, которые могут быть обнаружены во время проращивания во влажной камере, приведены в приложении D.
Чтобы стимулировать образование конидиеносцев и конидий с целью распознать отдельные грибные патогены, например Drechslera graminea Ito (полосатая пятнистость), Drechslera teres Ito (сетчатая пятнистость) и т.д., во время проращивания семян в чашках Петри, Коха или в стаканах с фильтровальной бумагой нужно 12-часовое дежурство света и тьмы (освещенность 750-1250 лк).
Во время анализа семян в рулонах фильтровальной бумаги используют два его слоя, увлажненные до полной вологонасичености. Отбирают четыре пробы по 50 или 100 семян. Для каждой пробы используют полоски фильтровальной бумаги размером соответственно 55 см х 10 см или 110 см х 10 см (± 2 см).
Семена раскладывают в одну линию с интервалом 1 см на расстоянии 2-3 см от верхнего и боковых краев бумажной полоски. Семена кладут зародышами вниз, а округлое — произвольно.
Расположен на бумаге семена накрывают такой же по размеру полоской увлажненной фильтровальной бумаги, на которую накладывают корекс или полоску полиэтиленовой пленки, и скручивают в рулон. Рулоны ставят вертикально в сосуды и помещают в термостат при температуре 22-25 ° С. В процессе проращивания семян не допускают подсыхания рулонов. Воду в поддоне термостата меняют каждые 3-5 суток.
Семена анализируют в сроки, предусмотренные для определения его сходства (раздел 7).
Во время анализа семян на питательных средах выделяют четыре пробы по 50 или 100 семян в каждой и помещают в стерильную посуду с питательной средой на картофельном, картофельно-глюкозный агар или среде Чапека.
Приготовление картофельного агара: 200 г вымытой, очищенной, нарезанной кусочками картофеля заливают 1 дм3 воды и кипятят в течение 40 мин, затем жидкость фильтруют. В отфильтрованную жидкость доливают воду до 1 дм3, добавляют 20 г агара и подогревают до его полного растворения. После этого раствор в горячем состоянии фильтруют через несколько слоев марли с ватной перекладкой и стерилизуют под давлением 0,09807 МПа (1 атм) или проточной паром. После стерилизации в питательную среду добавляют стерильный 50% раствор лимонной кислоты из расчета 0,05-0,1 см3 (одна капля) на 10 см3 или концентрированную молочную кислоту (4 см3 на 1 дм3 питательной среды) и жидкость разливают в чашки.
Приготовление картофельно-глюкозного агара: на 1 дм3приготовленого картофельного агара (11.4.2.5.3.1, перед стерилизации добавляют 20-ЗО г глюкозы, а после стерилизации — лимонную или молочную кислоту.
Приготовление питательной среды из сухого агара Чапека: на 1 дм3 воды берут 45-50 г сухого агара Чапека и раствор стерилизуют под давлением 0,09807 МПа (1 атм).
Стерилизация питательных сред
Стерилизация питательных сред проводят в автоклаве под давлением, без давления (проточной паром) или в кипятильнике. Питательные среды без глюкоза (на картофельном агаре и сухом агаре Чапека) стерилизуют под давлением 0,09807 МПа (1 атм) в течение ЗО мин, питательные среды с глюкозой (на кар- топляно-глюкозно агаре) стерилизуют под давлением 0,04904 МПа (0 5 атм) в течение 25 мин. Стери¬лизування питательных сред проточной парой проводят в два приема в течение 1 ч через сутки. В период между стерилизации жидкость держат при температуре 25-ЗО ° С.
Для анализа в стерильные чашки Петри диаметром 95-100 мм наливают 10 см3 простерилизованного агара высотой 3-4 мм. Разливки питательных сред в чашки и заделки семян проводят в бактериологической камере (стерильном боксе).
Семена промывают струей воды в течение 1-2 ч и дезинфицируют 1% раствором азотнокислого серебра или 96% -м спиртом в течение 1-2 мин. Затем семена промывают в стерильной или прокипяченной воде и просушивают между листами стерильного фильтровальной бумаги. Пробы семян в количестве 50-100 шт. помещают в чашки Петри (по 10-25 шт. в зависимости от культуры), раскладывают пинцетом, который периодически стерилизуют обжигом на спиртовке, на застывшее питательную среду и ставят их на проращивание в термостат при температуре 22-25 ° С. Проращивания и анализа семян проводят в течение срока, предусмотренного для определения сходства согласно приложению П.
Чтобы контролировать правильность определения болезней семена, небольшую часть колонии патогена, которая развилась на питательной среде, исследуют под микроскопом в капле воды, используя сведения приложений Ю, В, Г.
Люминесцентный метод
Люминесцентный метод используют как экспресс-метод для предварительного анализа зараженности семян некоторыми болезнями.
3 средней пробы берут четыре повторы по 100 семян, раскладывают на черную бумагу и просматривают под ультрафиолетовым осветителем. По характеру свечения семян делают вывод о наличии или отсутствии в нем возбудителя заболевания.
Здоровые семена пшеницы светится сине-голубым или сине-фиолетовым светом, а за¬ражене летящей головней — темное, тусклый.
Семена гороха в местах заражения аскохитозом или фузариозом светится тусклым коричнево красным светом.
Семена кукурузы, зараженное фузариозом, светится ярким оранжевым или мали¬новим светом.
Здоровые семена сои светится светло-голубым, а пораженные места -тьмяно-коричнево красным или темным светом.
В семенах свеклы, пораженном фомозом, светятся пикниды возбудителя болезни белым тусклым светом.

Зараженность семян болезнями определяют на основе первичных данных анализа. В каждой пробе подсчитывают общее количество зараженного определенными болезнями семян, в том числе бак¬териальнимы. При наличии на семенах и проростках одновременно двух и более болезней, зараженность каждой семена учитывают по переважальною по признакам болезнью. Если болезни проявились примерно в одинаковом количестве, то они учитываются по более вредной

Company Reviews

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *